如何使用试剂盒

新型冠状病毒的检测在过去一段时间内成为了被大家所关心的话题。一方面，早在1月上旬，科学家们对新型冠状病毒完成测序之后就有好几家企业加班加点两三天内完成了“核酸检测试剂盒”，并且产能看起来颇为足够。但另一方面，即使中旬后放开了检测标准，不需要通过国家疾控中心才能确诊，仍然有大量患者无法得到确诊。这其中的检测卡口以及使用试剂盒检测的难点到底在哪呢？

乍听起来，试剂盒好像是类似于化学课上酸碱试纸那样的东西，滴一滴就会变色。可实际上它的用法与最初的想象大不相同，复杂多了。

确诊由病毒引起的疾病有几种方式。从大类上分，可以直接检测病毒的核酸，或者检测病毒中会让人产生免疫反应的抗原，或是检测人体免疫反应所产生的抗体。由于科学家迅速对病毒完成了测序，因此这次最早完成设计生产的试剂盒也是属于检测核酸的类别。它使用的方法叫做PCR（聚合酶链式反应），能够快速对微量DNA进行检测，并且相当灵敏。除了生物领域以外，它在法医和考古等领域也有着重要的应用。顺带一提，这两天出现的一种能在15分钟内完成检查的快速检测盒是属于检测抗体的类型，不过关于那种测试方法，就需要另外一篇文章来解释了。（详见《Lagniappe - 如何使用试纸》）

检测冠状病毒的时候会采取病人的鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等作为样本——换言之就是可能包含有病毒的东西。之后，需要用试剂提取出其中的核酸部分。由于冠状病毒的遗传物质是单链的RNA，因此还需要使用逆转录酶将RNA逆转录为DNA。

回顾一下中学生物有关DNA的内容：DNA是生物体内记录信息的物质，呈双链结构。每条链都由一系列核苷酸组成。每个核苷酸会携带四种碱基之一：A，T，C和G。两条链之间按A-T和C-G的碱基互补规则匹配。检测病毒时，样本内不只有病毒的核酸，还有人体细胞以及其他各种正常存在的细菌、病毒的核酸。打个比方的话，就好像是要求从一个杂乱无章的图书仓库里找出有没有西游记一样。PCR的想法就是对需要的DNA片段进行复制。如果有一种专门负责抄写西游记的小妖怪，一本抄两本，两本抄四本，那只要仓库里有一本西游记，很快就能让仓库里出现大量的西游记，到时候再检测就容易多了。

这种小妖怪听起来很神奇，实际上模拟的正是我们体内每天都在进行的DNA复制。PCR首先会用高温让DNA变成单链，然后利用两种物质进行DNA复制过程：一种叫“引物”，是一小串核苷酸链，能自动结合到能够匹配的DNA片段上。可以把它想像成一个神奇书签。预先往书签上写好几个字，它就可以自动找出仓库里写有这几个字的书页粘上去。另一种叫“聚合酶”，会从引物开始，为单链DNA补齐另外一条。它相当于一个抄书匠，会从神奇书签开始抄书。这样就产生了“扩增”“特定”DNA片段的效果。设计病毒的核酸检测试剂盒的过程主要是根据病毒的测序结果选择其中的几个有特征的基因，并在每个基因靠近头尾的地方选取两串引物。为了保证实验效果，对引物还有一些额外的要求，比如活性温度必须适当，引物之间不能结合等等。

除了复制以外，还需要检测扩增过程是否顺利。目前的试剂盒采用的是荧光探针法。荧光探针是带有两个额外基团的小串核苷酸链，其中一个能放出荧光。但是，探针完整时荧光会被另一个基团吸收。在DNA复制过程中，聚合酶会将荧光探针分解，产生荧光。这就像是一个有着荧光膜的神奇书签。抄书匠在抄书过程中一旦发现就会撕掉。DNA每扩增一次理论上就会多一倍荧光分子，这样就可以根据荧光的强度看出DNA扩增的次数。如果原始样品里有目标片段，荧光的强度就会随着扩增次数指数增长。如果没有目标片段，就不会产生新的荧光分子。

这整套测试过程需要实时荧光定量PCR系统来完成，它有着温度控制和实时检测荧光强度的功能。分解DNA成单链、引物结合和聚合酶工作的反应温度均不相同，仪器需要以固定的时间间隔在两个温度间循环（后两者所需温度差不超过3摄氏度时可以用一个温度）。检测荧光强度则需要包含光源和探测器的装置。光源能够精密地照射到每一个样品上，然后由探测器检测荧光的强度。随着扩增循环，荧光强度就会画出一条曲线，用以判断目标DNA片段是否存在。按照目前新闻的报道，PCR每批测试时间需要2-4个小时，普通PCR仪一次可以对96个样本进行测试，高级的PCR仪可以一次做384个样本，武汉市内十个实验室每天总共可以检测2000多例。（到文章发布为止，湖北省内据说每天可以检测4000多例）

除此之外，由于PCR技术异常灵敏，因此需要专门的实验室和人员进行操作。在基本的实验室布置中，储藏试剂、准备样品和进行PCR需要在三个不同的房间进行，并且还需要PCR室保持负压洁净状态，即PCR室的空气不会流入其他房间，这样才可以保证样品不会受到扩增后的DNA产物污染。而如果针对病毒处理的话，还要求实验室需要具备相应的病毒防护资质才可以（当然不需要P4级别那么高）。整套下来并非所有医院都能轻松配备。这一定程度上成为了病人无法确诊的实际瓶颈：仪器容易购置，测试人员可以找到，试剂盒并不缺，但是符合相应标准的实验室相当有限（武汉市内一共10家）。

而针对病人，一个病人在病程中可能需要经历至少三次测试：一次确诊（结果阳性，视病程不同也可能因为假阴性而重复几次）与判断治愈需要的两次测试（要求结果阴性），而目前每天新增的疑似病人也超过了湖北省内的处理能力。所以虽然生产试剂盒的数量远远大于疑似人数，但实际做测试的数目还是非常有限的。

来自@ Andeling 的补充：中国CDC版本的protocol实在没找到，美国的版本一个96孔板只能测20个样品（这还没在样品之间留空行/空列），因为每个样品要qPCR三个病毒target加上一个QC target。https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html

PS：近期同时还会更新Lagniappe，是关于抗体是怎么通过试纸检测的。大家在家需要注意自己的心态调节，出门请格外注意防护，我们一起共度时艰。

PSPS：本篇得到了Vincentheo的大力协助，爱你。

荧荧鬼火色 满城乱象皆噤声 哀哀哭新坟

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